Как отличить качественные пробиотики?

05.07.2024

Как отличить качественные пробиотики?

Организм животных и птиц в индустриальных хозяйствах поставлен в очень жесткие условия: генетика, селекция и состав рационов нацелены на сверхпродуктивность, а всевозможные стрессы буквально являются неотъемлемой частью производства. В условиях целого комплекса негативных факторов возможности пробиотиков обязательно должны реализовываться на самых разных уровнях воздействия, не ограничиваясь одним-двумя параметрами. Однако, несмотря на длительный опыт применения пробиотиков в практике птицеводства, обоснование их применения и критерии выбора остаются предметом дискуссий.

Нередко российские производители продукции сельского хозяйства не доверяют отечественным биопрепаратам. Принято считать, что наши пробиотики «не работают», они некачественные и вообще «импортное лучше». Откуда берутся самые распространенные заблуждения о российских препаратах и насколько они соответствуют действительности? Частично недоверие к пробиотикам могло иметь под собой основу, поскольку на рынке стали появляться откровенные аферисты.

Появление огромного количества непроверенных препаратов во многом дискредитировало производителей пробиотиков. В итоге препаратам, которые разработаны в результате многолетнего труда и производятся в соответствии с современными научными стандартами, нанесен гигантский репутационный урон. 

Золотой стандарт качества

Созданная 8 сентября 1999 года, компания «БИОТРОФ» сегодня является ведущей биотехнологической фирмой России с большим ассортиментом препаратов: это не только пробиотики, но и фитобиотики, метабиотики, биологические консерванты, комплексные энтеросорбенты токсинов. Гарантией качества пробиотиков НПК

«БИОТРОФ» является уникальность биопрепаратов собственной разработки, большинство из которых запатентованы и имеют свои товарные знаки. Идейный вдохновитель и создатель компании — доктор биологических наук, лауреат премии Правительства РФ Георгий Юрьевич Лаптев. Всю свою жизнь ученый занимался изучением микробиоты пищеварительной системы животных и кормов, начинал в 1977 году в аспирантуре, а затем с 1982 года работал в НИИ сельскохозяйственной микробиологии в группе зоотехнической микробиологии, созданной по инициативе академика Л.К. Эрнста.

Селекция  пробиотических  препаратов в  научно-производственной  компании «БИОТРОФ» с использованием метода полногеномного секвенирования позволила существенно расширить спектр возможностей пробиотиков, что является первостепенной задачей в условиях синергизма рисков, возникающих при ведении интенсивного животноводства и птицеводства.

Соответствие содержимого этикетке

Исследования,  документирующие пробиотические свойства конкретного штамма в тестируемой дозе, не являются доказательством аналогичных свойств штамма одноименного вида в этой же или других дозировках.

Однако, по мнению многих специалистов ферм и птицефабрик, существенных отличий в эффективности и безопасности между пробиотиками не должно быть — ведь создатели используют один и тот же вид бактерии. Тем не менее подобная взаимозаменяемость недопустима.

Многие из биопрепаратов не имеют государственной регистрации; более того, в самом законодательстве нашлись лазейки, пользуясь которыми, многие импортеры, а также некоторые отечественные производители стали активно применять способы так называемой недобросовестной конкуренции, чтобы занять место на рынке. При этом потребителя часто вводят в заблуждение относительно качества продукции.

По этой причине в лаборатории НПК «БИОТРОФ» регулярно проводится анализ соответствия реального видового состава и бактериального титра микроорганизмов, входящих в пробиотики, титру и видовому составу, заявленному производителем. Для этого используется совокупность молекулярно- генетических (включая высокопроизводительное NGS-секвенирование всех 100% микроорганизмов, полногеномное секвенирование) и классических методов микробиологии.

Так, с помощью NGS-секвенирования был проверен реальный видовой состав микроорганизмов, входящих в пробиотик, производимый зарубежной компанией (Китай) якобы на основе Bacillus subtilis. Как оказалось, реальный состав пробиотика лишь на 0,18% соответствовал заявленному производителем (рис. 1). Более того, в составе препарата выявлялись условно- патогенные и патогенные формы микроорганизмов! Например, доля энтеробактерий составляла 16,9%. В условиях сниженного адаптационного потенциала и иммуносупрессии высокопродуктивных животных и птицы одним из сценариев применения такого «пробиотика» может стать даже массовый падеж поголовья.

Рис. 1. Состав пробиотика зарубежного производства: А — состав согласно паспорту качества, Б — реальный состав, определенный методом NGS-секвенирования, %

В чем же причина несоответствия состава пробиотика? Дело в том, что в погоне за удовлетворением потребительского спроса практически никто из производителей пробиотиков не желает потратить время и понести колоссальные финансовые затраты, чтобы грамотно заниматься разработкой пробиотика с нуля до финального продукта — в таком случае это занимает 20 лет. Такие биопрепараты, возникшие ниоткуда, — это своего рода рулетка, и никогда нельзя знать наверняка, соответствует ли состав паспорту качества и какой ожидается эффект.

Ошибки могут быть не только на этапе разработки, но и в процессе производства. Дело в том, что эксплуатация ферментеров, необходимых при производстве пробиотических бактерий, связана со многими факторами риска.

С другой стороны, контролирующие инстанции всегда имеют возможность внезапно прийти на завод, расположенный в России, изъять образцы препарата, проверить их качество, условия, в которых препарат производится. В отношении зарубежных производителей такой возможности нет.

 Не сойти с дистанции

Чтобы понять, ожидать ли позитивный эффект от пробиотика, следует выяснить, будут ли штаммы в его составе выживать в условиях кишечника, а также образовывать там колонии, что позволит вступить в активную конкуренцию с представителями нежелательной микробиоты. К сожалению, исследования показали, что у бактерий в составе большинства имеющихся на рынке пробиотиков отсутствует свойство устойчивости к агрессивным факторам среды пищеварительной системы. Поэтому до кишечника, где они и призваны работать, бактерии часто не доходят живыми или доходят, но в ничтожном количестве.

Использование молекулярно-биологических возможностей компании НПК «БИОТРОФ» сделало работу по селекции и изучению механизмов действия штаммов бактерий в составе пробиотиков еще более результативной. Впервые в России получены «генетические паспорта» на кормовые пробиотики в результате проведения полногеномного секвенирования, которое позволяет оценить функцию каждого гена в составе генома и описать все механизмы действия и биологический потенциал на молекулярном уровне.

Применение таких методик позволило получить уникальные по составу пробиотики (Профорт, Профорт-Т, Пробиоцид-Ультра, Ликвипро, Провитол и др.) с целым набором специфических генов, благодаря которым они способны адаптироваться, выживать и эффективно увеличивать численность в условиях кишечника, вытесняя условно- патогенную и патогенную микробиоту. Выстилать и колонизировать поверхность слизистой кишечника штаммам позволяет способность формировать биопленки, устойчивые к агрессивным факторам внешней среды. Эта способность определяется выраженными свойствами к адгезии благодаря наличию различных поверхностных структур: жгутиков, пилей и белков наружной мембраны. После завершения адгезии бактерии начинают активно выделять экзополисахариды, заполняющие межклеточное пространство, что обеспечивает устойчивость к действию повреждающих физико- химических факторов.

Так, например,  была проведена экспериментальная оценка выживаемости штаммов бактерий Bacillus sрp. и Enterococcus faecium в составе пробиотика Профорт при имитации их продвижения по пищеварительному тракту. Изучение выживаемости микроорганизмов проводили согласно методическим рекомендациям МР «Оценка безопасности наноматериалов» (приказ

№ 280 от 12.10.2007 г.) и в соответствии с методикой Дармова и др. (2011). При этом учитывалось влияние совокупности повреждающих физико-химических факторов желудочно-кишечного тракта: соляная кислота желудка, пищеварительные ферменты. Проверка жизнеспособности пробиотических бактерий при прохождении различных отделов ЖКТ показала, что сохранность бактерии Bacillus sрp. составляла 100%, сохранность Enterococcus faecium также была на достаточно высоком для достижения пробиотического эффекта уровне — 80%.

 При тепловом стрессе

Как было отмечено, современные условия ведения интенсивного птицеводства выдвинули ряд серьезных требований к пробиотическим препаратам, которые должны не только изменять состав и функции микробиоты в просвете кишечника, но и оказывать комплексное воздействие на организм хозяина: активировать пищеварение и всасываемость питательных веществ, усиливать барьерную функцию эпителия, противостояние стрессам и токсинам, модулировать иммунный ответ и т.д.

Так, наступившая летняя пора привносит в жизнь не только положительные эмоции. В жаркое время года одной из серьезнейших проблем для производителей птицеводческой продукции является тепловой стресс у птицы, ухудшающий практически все ее продуктивные показатели.

Для снижения стрессов принято использовать добавки с селеном и ряд витаминов, однако биодоступность таких веществ в основном низкая. Что касается селена, то его токсическая доза крайне мала и сопоставима с минимальным терапевтическим эффектом. То есть даже незначительная передозировка, которая может возникнуть при его высоком содержании в кормах и в организме, вызывает побочные эффекты у животных и птицы.

Поэтому в настоящее время главным принципом борьбы с тепловыми стрессами должна стать естественная активация собственных резервов организма, преждевсеговосстановлениеиммунитета и улучшение здоровья кишечника путем регуляции микробиома. Эффективной антистрессовой защитой обладает метапробиотик нового поколения Пробиоцид-Ультра, объединяющий комбинацию естественных бактериальных метаболитов (фумаровой и лимонной кислот) и двух штаммов Bacillus sрp., действующих в синергизме. Пробиоцид-Ультра не только эффективно стимулирует рост нормобиоты кишечника, выполняя функции классического пробиотика, но и в несколько раз повышает способность подавлять рост патогенных бактерий благодаря подкисляющей способности органических кислот. Кроме того, биопрепарат позитивно действует непосредственно на организм хозяина.

В условиях вивария был проведен опыт по скармливанию метапробиотика Пробиоцид-Ультра цыплятам-бройлерам кросса «Росс 308».

Было сформировано две группы: контрольная, получавшая основной рацион (ОР), и опытная, получавшая в дополнение к ОР метапробиотик Пробиоцид-Ультра. Птица контрольной и опытной групп на протяжении выращивания подвергалась воздействию повышенных температур, не соответствующих рекомендациям (выше верхней границы нормы от 1 до 12°C в зависимости от периода содержания).

Применение метапробиотика Пробиоцид- Ультра позволило снизить негативные последствия теплового стресса, что выражалось в улучшении зоотехнических показателей: сохранности поголовья, живой массы и конверсии корма (рис. 2). Так, например, при применении метапробиотика удалось избежать 9,3% дополнительных потерь поголовья.

Рис. 2. Влияние метапробиотика на продуктивность бройлеров в условиях теплового стресса

Иммунная система птицы на фоне теплового стресса требует особого внимания, поскольку она наиболее чувствительна к данному негативному фактору: резистентность к патогенам падает, а вакцинации становятся неэффективны. Наиболее разрушительные последствия стресса возникают в кишечнике, который является самой обширной областью тела, подвергающейся воздействию окружающей среды, и местом нахождения большинства иммунных клеток.

Введение в рацион птицы метапробиотика приводило к снижению в тканях слепых отростков кишечника экспрессии провоспалительных генов, таких как PTGS2, и гена апоптоза (клеточной гибели) Casp6 (рис. 3).

Рис. 3. Влияние метапробиотика в условиях теплового стресса на продуктивность бройлеров на 21-е сутки выращивания

Это важный вывод, поскольку тепловой стресс характеризуется иммуносупрессивным потенциалом. Одним из основных факторов, влияющих на снижение продуктивности птицы в условиях стресса, является стимуляция воспалительных процессов в кишечнике. Ключевой момент для запуска этих процессов — потеря целостности кишечного барьера, которая имеет связь с апоптозом. Нарушенный кишечный барьер — это ворота для проникновения в организм кишечных патогенов. Параллельно отмечено значительное стимулирующее влияние биопрепарата на гены β-дефензинов 9 и 10, имеющих защитное действие против патогенов. Так, уровень экспрессии Gal9 в опытной группе повышался в 181 раз по сравнению с контролем, Gal10 — в 131 раз.

Противостоять токсическому стрессу

Повсеместное использование гербицидов с начала их применения увеличилось в геометрической прогрессии. Глифосат — наиболее распространенный гербицид широкого спектра действия, входящий в состав препарата Roundup (Monsanto).

В 1990-е производитель создал устойчивые к нему генно-модифицированные сельскохозяйственные культуры — сою, кукурузу, хлопок. Зерновые, кукуруза и соя — основные компоненты кормов для сельскохозяйственной птицы. Устойчивые к данному гербициду культуры содержат глифосат и/или его метаболиты в широком диапазоне концентраций. Тем не менее глифосат считался малотоксичным для животных и человека. Процесс обрушения мифа о безопасности начался, когда ученые Международного агентства по исследованиям рака (IARC) в результате собственного исследования классифицировали это действующее вещество как «вероятно канцерогенное».

При поддержке проекта Российского научного фонда № 22-16-00128 (руководитель — д-р биол. наук Лаптев Г.Ю.) впервые в России мы получили уникальные результаты анализа дифференциальной экспрессии всех генов, присутствующих в геноме, в тканях кишечника у птицы с помощью высокопроизводительного RNA-seq на фоне различных дозировок глифосата.

Результаты наших исследований оказались достаточно тревожными: глифосат, содержащийся в кормах для птицы, даже в минимальных концентрациях, которые в несколько раз ниже уровней ПДК для кормов, при хроническом воздействии негативно влиял на экспрессию 11 тысяч генов. В частности, глифосат вызывал активацию (от десятков до тысяч раз и более) генов апоптоза, т.е. клеточной гибели (Casp1, Casp2, Casp6, Casp8, Casp9), провоспалительных интерлейкинов (IL1β, IL4, IL7, IL8, IL10, IL15, IL18, IL22). Одновременно глифосат резко ингибировал экспрессию генов, связанных с продуктивностью и репродуктивным долголетием. Это выражалось в снижении показателей иммунитета, изменении биохимических параметров крови, активности пищеварительных ферментов, снижении продуктивности птицы.

Несмотря на запреты, в программах профилактики бактериальных инфекций в практике птицеводства продолжают использовать антибиотики. В связи с этим мы провели эксперимент по совместному влиянию антибиотиков, глифосата и пробиотика на продуктивность бройлеров. Бройлеры I (контрольной) группы получали основной рацион (ОР) без добавок; II опытной — ОР с антибиотиками энрофлоксацином и колистином; III опытной — ОР с этими же антибиотиками и глифосатом на уровне 1 ПДК; IV опытной группы — ОР с антибиотиками, глифосатом и биопрепаратом Пробицид-Ультра. Динамика живой массы птицы на 28-е и 35-е сутки показана на рис. 4.

Рис. 4. Живая масса бройлеров в группах на 28-е (А) и на 35-е (Б) сутки

Антибиотики стимулировали увеличение продуктивности бройлеров, что является известным фактом. На 35-е сутки зафиксировано негативное влияние глифосата на этот показатель, выражавшееся в снижении ростостимулирующего эффекта антибиотиков. В связи с этим нами был изучен механизм изменения продуктивности на клеточном уровне. Наблюдая за РНК птицы, методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией мы провели анализ экспрессии (работы) генов в грудных мышцах бройлеров, связанных с ростом и формированием мышечных волокон (lgf-1, MYOG, MYOZ2), на 35-е сутки (рис. 5).

Рис. 5. Уровень экспрессии генов в грудных мышцах бройлеров

Повышенная активность гена MYOG во II и IV опытных группах (на фоне антибиотиков) явилась фактором, способствующим развитию мышц во время миогенеза, усилению митохондриальной функции и повышенному накоплению энергии у бройлеров. Безусловно, это играет определенную роль в наблюдаемом увеличении живой массы в вариантах с антибиотиками. Тем не менее в группе с добавлением в комбикорма глифосата на фоне антибиотика без введения биопрепарата (III группа) эффект активации экспрессии гена MYOG не отмечался по сравнению с контролем, что свидетельствует, с одной стороны, о негативном влиянии глифосата на экспрессию генов продуктивности птицы, с другой — о некотором сглаживании данного негативного эффекта при интродукции штамма микроорганизма.

Эффективность при кормовых стрессах

Не за горами пора уборки фуражных зерновых культур. Осенью из-за высокой стоимости зерна прошлогоднего урожая многие птицефабрики перейдут на использование для птицы свежесобранного зерна. Однако скармливание зерна нового урожая приводит к целому спектру проблем: гастроэнтеритам, снижению поедаемости и приростов. В зерне после сбора урожая длительное время продолжаются метаболические процессы

«дозревания» за счет активизации деятельности ферментов. Эти процессы подходят к завершению только через несколько месяцев хранения зерна. Минимально допустимое время созревания зерна — 60 суток.

Дело в том, что в свежесобранном зерне содержание растворимых некрахмалистых полисахаридов (НПС) в несколько раз превышает содержание нерастворимых НПС.

Растворимые НПС способны связывать большое количество воды. Это вызывает увеличение вязкости химуса (содержимого) кишечника и снижение переваримости углеводов, белков и жиров, а также скорости всасывания питательных веществ.

Большая гигроскопичность растворимых НПС влечет за собой нарушение водного режима кишечника и разжижение экскрементов. Это приводит к повышенному загрязнению яиц, увеличению влажности подстилки, повреждениям ног, ожогам костей.

Продуцирование ферментов пробиотическими бактериями — это один из самых результативных способов доставки энзимов в кишечник, а значит, наиболее эффективный метод преодоления негативного воздействия свежесобранного зерна на организм птицы.

Ферментные комплексы штамма бактерии в составе пробиотика Целлобактерин+, в отличие от чистых единичных ферментов, воздействуют на различные компоненты структурной клетчатки корма (целлюлозу, гемицеллюлозу и пр.), причем как на растворимые, так и на нерастворимые. Использование базы данных Cazy Французского национального центра научных исследований для биоинформатической обработки данных секвенирования позволило детально охарактеризовать у штамма весь спектр ферментов (гликозилгидролаз), активных в отношении НПС. Доказано, что сложные ферментные системы штамма бактерии в составе пробиотика Целлобактерин+ объединены в целлюлосомы — выступы, образующиеся на клеточной стенке целлюлозолитических бактерий. Эти выступы представляют собой стабильные ферментные комплексы, которые прочно связаны со стенкой бактериальной клетки, но при этом они достаточно гибкие, чтобы также прочно связываться с расщепляемыми субстратами — целлюлозой, гемицеллюлозой и другими НПС. Это значительно облегчает гидролиз НПС за счет механизма приближения каталитического домена (участка) к расщепляемому субстрату и дальнейшему связыванию с его поверхностью (рис. 6).

Рис. 6. Целлюлосома штамма бактерии в составе пробиотика Целлобактерин+

В то же время преимущества биопрепарата выходят далеко за рамки простого улучшения переваривания               питательных  веществ. Целлобактерин+ оказывает многостороннее воздействие на желудочно-кишечный тракт птицы: на 25–30% увеличивает в кишечнике количество собственных целлюлозолитических бактерий, одновременно вытесняя и патогенную микробиоту: сальмонелл, пастерелл, золотистого стафилококка, энтеробактерий и др. Происходит восстановление баланса микробиоты, нарушенного погрешностями в кормлении.

Исследование, проведенное в ООО «Нижнетагильская птицефабрика» на поголовье яичной птицы, показало, что применение пробиотика Целлобактерин+ в несколько раз снизило негативный эффект от введения в рацион зерна нового урожая. В результате применения препарата увеличилось высвобождение питательных веществ корма, улучшилась их переваримость и всасываемость, уменьшилась вязкость химуса и количество патогенов.

Как отметили специалисты птицефабрики, в результате применения биопрепарата произошло снижение доли яиц с загрязненной скорлупой с 12% до 5% (рис. 7). На поголовье молодой птицы отмечено явное улучшение показателей по однородности стада. До применения биопрепарата однородность стада не превышала 92%, с биопрепаратом Целлобактерин+ этот показатель вырос до 97–98%. У взрослой птицы удавалось не только сдерживать снижение продуктивности, но даже повысить уровень яйценоскости на 1–2%.

Рис. 7. Эффективность использования пробиотика Целлобактерин+ на поголовье яичной птицы в период скармливания зерна нового урожая

Не все одинаково полезны

На рынке представлено много препаратов, позиционируемых как пробиотики. Однако настоящими пробиотиками является лишь часть из них. От правильного выбора пробиотика зависит состояние всего организма, продуктивность и срок хозяйственного использования. Совершенно очевидно, что в качестве пробиотиков должны применяться штаммы бактерий, полученные в результате длительной селекционной работы, имеющие доказанный широкий спектр физиологических эффектов, в том числе свойства выживать в условиях агрессивной среды ЖКТ и колонизировать стенки кишечника. Состав бактерий в препаратах должен соответствовать заявленному в паспорте качества, пробиотики не должны содержать нежелательной микробиоты, тем более патогенной.

В условиях интенсивного животноводства и птицеводства многочисленные производственные стрессы — средовые, кормовые, токсические, технологические — изменяют микробиом кишечника и экспрессию генов организма в негативную сторону, поэтому во многих хозяйствах реализовать генетический потенциал поголовья в полной мере не удается.

Терапевтические возможности пробиотиков обязательно должны реализовываться на самых разных уровнях воздействия, не ограничиваясь одним-двумя параметрами.

Именно поэтому производство биопрепаратов для животных и птицы это прежде всего наукоемкий процесс, включающий многоэтапную селекцию высокоэффективных штаммов микроорганизмов с учетом комплекса проблем, встающих на пути ведения интенсивного производства продукции, всестороннее изучение механизмов действия, проверку свойств во множестве лабораторных и производственных экспериментов и, безусловно, постоянный контроль качества во время процесса производства.