Подписка на обновления
|
Мониторинг здоровой микрофлоры: подсчет живых спор в готовых кормах как часть контроля качества пробиотических продуктов и их эффективностиМониторинг здоровой микрофлоры: подсчет живых спор в готовых кормах как часть контроля качества пробиотических продуктов и их эффективностиВ условиях современного высокоэффективного птицеводства и свиноводства животные подвергаются постоянному воздействию стрессовых факторов, которые могут увеличивать их восприимчивость к кишечным заболеваниям, приводящим к снижению продуктивности, подавлению иммунитета и повышению смертности. Для сохранения и улучшения показателей продуктивности в таких условиях долгое время широко использовались кормовые антибиотики в профилактической дозировке. Тем не менее в последние годы наблюдается ужесточение правил использования антибиотиков в животноводстве с целью недопущения их попадания в продукты питания людей, а также в связи с появлением антибиотикорезистентных штаммов болезнетворных бактерий, представляющих собой растущую угрозу для здоровья и жизни человека. По этой причине специалисты отрасли животноводства осуществляют поиск эффективных альтернатив кормовым антибиотикам. Спектр потенциальных заменителей очень широк — функциональные кормовые добавки, такие как пробиотики, пребиотики, органические кислоты, ферменты, растительные экстракты и минеральные цеолиты, уже активно используются и оказывают положительное действие на конверсию корма, здоровье и рост животных. Одной из наиболее перспективных групп являются пробиотики. Пробиотик — это живая микробиологическая кормовая добавка, которая положительно влияет на животное путем улучшения баланса его кишечной микрофлоры (Fuller, 1989). Установлено, что пробиотики способствуют развитию и поддержанию стабильного микробиома кишечника птицы, что приводит к сокращению частоты кишечных заболеваний и повышению продуктивности (Ducatelle et al., 2015). Они также способствуют улучшению конверсии корма, снижению смертности, модулированию иммунного ответа и защите от кишечных патогенов (Siragusa, 2012). Наиболее часто в птицеводстве используются различные штаммы видов рода Bacillus (B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. subtilis), имеющие способность к образованию индивидуальных спор для выживания в неблагоприятных условиях. Данная особенность очень важна при разработке пробиотических продуктов, т.к. они являются живыми микробиологическими добавками и не должны утратить свои свойства до попадания в кишечник животного. В процессе производства кормов, и в особенности при их гранулировании, некоторые пробиотики могут терять свою жизнеспособность. Концентрация пробиотических продуктов, как правило, выражается в количестве колониеобразующих единиц на грамм или килограмм (КОЕ/г или КОЕ/кг). Ввиду специфичности пробиотиков очень важно гарантировать заявленную концентрацию живых спор как в корме, так и в самом продукте. С целью поддержки клиентов на долговременной основе компания «Эвоник» предлагает новый сервис по подсчету жизнеспособных спор. Эксперты проводят специальный анализ образцов кормов и пробиотических продуктов для определения присутствия в них спор бактерий с заявленными свойствами (Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens и Bacillus licheniformis). Полученные результаты позволят совершенствовать корма путем добавления в них нужных пробиотических добавок, что даст гарантию работы пробиотика для укрепления здоровья и поддержания продуктивности животных. Процесс подсчёта спор основан на официальных методиках VDLUFA 28.2.2 (Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis), VDLUFA 28.2.3 (Enterococcus faecium), VDLUFA 28.1.2 (общее количество аэробных микробов). Данные методики в целом заключаются в приготовлении начальной суспензии из образца корма (содержащего 1E6–1E8 КОЕ/г) с добавлением различных дополнительных реактивов (NaOH, раствора казеинового пептона, NaCl в индивидуальных пропорциях) с последующей гомогенизацией и тепловой обработкой или без нее. Разведение раствором гидроксида натрия разрушает вегетативные клетки. Приготовление препарата выполняется на агаровых чашках Петри на различных средах в зависимости от типа бактерий с помощью автоматического аппарата для спирального посева. Чашки обычно инкубируются в течение 18–24 часов при различных температурах (обычно от 30 до 37°C). В случае если ясно видимые колонии не образуются, чашки инкубируются еще 24 часа. Затем проводится подсчет типичных колоний. Морфология учитывается в качестве дополнительного критерия оценки. Подсчет колониеобразующих единиц выполняется на основе логарифмического распределения. Результаты представлены в колониеобразующих единицах на грамм корма (КОЕ/г).
Примеры вычислений Пробиотический препарат может иметь следующую спецификацию: 2,0×109 КОЕ/г. Это равнозначно 2 000 000 000 КОЕ/г и обозначается как 2 E9 КОЕ/г. Если уровень ввода продукта составляет 500 г/тонну, то целевое содержание в готовом корме будет равно: 1,0×106 КОЕ/г (2,0×109×500/1 000 000) = = 1 000 000 КОЕ/г = 1 E6 КОЕ/г, или 6 log10 КОЕ/г. 1 шаг логарифма в биологии описывает изменение концентрации популяции организмов в десятикратном размере. Следует учитывать, что указанные методики не могут сравниться в своей точности с методиками классической жидкостной химии и имеют допустимую погрешность в ±0,5 (log10 КОЕ/г).
«Эвоник» уже давно ведет мониторинг различных пробиотиков, представленных на рынке кормовых добавок. Результаты лабораторных исследований сотен пробиотиков на основе Bacillus показали, что многие из испытуемых образцов были загрязнены патогенными бактериями, дополнительными видами Bacillus, неспецифическими штаммами или комбинацией вышеперечисленного (рис. 2).
Кроме того, заявленная концентрация спор не всегда соответствовала их фактическому содержанию: она могла быть как выше, так и ниже значений, указанных в спецификациях продуктов. Следовательно, производители пробиотиков должны проводить различные микробиологические и химические анализы для подтверждения отсутствия загрязнений готовоuо продукта диоксинами, токсинами, тяжелыми металлами, бактериями и грибками, включая другие пробиотические штаммы, не указанные на этикетке. Кроме того, производители должны гарантировать и проверять количество бактерий и их соответствие заявленному штамму для каждой партии продукта с использованием не только идентификационного анализа на основе культуры, но и методов ПЦР с применением специфических праймеров для определенного штамма.
Компания «Эвоник» всегда руководствуется строго научным подходом при продвижении продукции, поэтому с целью подтверждения заявленных свойств пробиотической добавки Ecobiol® (B. Amyloliquefaciens CECT 5940) благополучно переносить довольно жесткие этапы гранулирования комбикорма, в том числе и в присутствии дополнительных средств борьбы с патогенами, в России и за рубежом был организован ряд тестов по проверке его термостабильности.
Устойчивость штамма Bacillus amyloliquefaciens CECT 5940 (Ecobiol®) в промышленных условиях гранулирования в России
Материалы и методы Тест был проведен на двух площадках одного комбикормового завода на территории РФ. В ходе теста были отобраны образцы корма для бройлеров в нескольких точках (этапах) производства. Такие технологические параметры, как температура и длительность экспозиции, соответствовали стандартной технологии, принятой на данном производстве, и составляли: 1) смеситель-кондиционер — 67°C и 80 с; 2) экспандер — 97°C и 10 с; 3) гранулятор — около 95°C и 5 с. Объем одной опытной партии составил 4 тонны. Всего было выработано 2 партии. Норма ввода пробиотического продукта Ecobiol® 500 (концентрация B. amyloliquefaciens CECT 5940 — 2×109 КОЕ/г) в комбикорма для бройлеров (стартовый период) составила 500 грамм на тонну. Расчётная (ожидаемая) концентрация спор в готовом корме — 1×106 КОЕ/г, или 6,00 log10 КОЕ/г. Подсчёт спор был проведен в 6 образцах готового комбикорма для определения концентрации на протяжении всего процесса производства по методике VDULFA 28.2.2. Результаты подсчёта спор и степени восстановления представлены в табл. 1.
Результаты и обсуждение Споры B. amyloliquefaciens CECT 5940 (Ecobiol® 500) в составе стартерного комбикорма для бройлеров были способны к прорастанию и образованию колоний на питательной среде после обработки корма в смесителе-кондиционере, экспандере и грануляторе при температурах 67°C (80 с), 97°C (10 с), 95°C (5 с) соответственно. Степень восстановления спор в образцах составила от 93 до 98%, снижение в шаге log10 КОЕ/г к целевому значению колебалось в рамках погрешности методики VDULFA 28.2.2 (±0,5 log10 КОЕ/г). Ecobiol® 500 может быть использован в комбикормах для бройлеров при вышеуказанных условиях грануляции без негативного влияния на качество готового корма.
Устойчивость штамма Bacillus amyloliquefaciens CECT 5940 (Ecobiol®) в промышленных условиях гранулирования в США в комбинации с антимикробным компонентом
Пробиотики широко применяются в гранулированных кормах в птицеводстве. Помимо положительного влияния на питательность, гранулирование способствует снижению уровня патогенных микроорганизмов в кормах (Doyle, Erickson, 2006; Richardson et al., 2017). Однако одного только гранулирования может быть недостаточно для уменьшения количества патогенов, т.к. на это могут влиять их уровень содержания в кормовых ингредиентах, соотношение температуры/влажности в процессе гранулирования и повторное загрязнение после него (Doyle, Erickson, 2006). Поэтому применение дополнительных средств борьбы с патогенами стало распространенной практикой. Органические кислоты и формальдегид-содержащие средства, включая Termin-8® (торговая марка формальдегида, пропионовой кислоты, метилового спирта и других ингредиентов), являются примерами антимикробных средств, доступных для использования при производстве кормов в США (Anderson et al., 2002).
Процесс гранулирования или его совмещение с антимикробными продуктами может отрицательно сказываться на свойствах некоторых ингредиентов (Thomas et al., 1998) и кормовых добавок, особенно таких как живые микроорганизмы, содержащиеся в пробиотиках. В большинстве случаев споровая форма Bacillus spp. выдерживает высокие температуры, влияние химических веществ и процессов сушки. Однако ее стабильность на протяжении всего процесса обработки кормов, например, в условиях гранулирования с применением пара, может изменяться в зависимости от штамма.
Следовательно, испытание конкретных пробиотических продуктов в таких условиях имеет решающее значение для понимания того, подходит ли штамм для применения в процессе обработки кормов. Целью настоящего исследования было определение стабильности штамма Bacillus amyloliquefaciens CECT 5940 (Ecobiol®) в условиях промышленного производства кормов, включающего его предварительное смешивание с Termin-8® с последующим гранулированием при различных температурах.
Материалы и методы Данное исследование было проведено в сотрудничестве с известной компанией — производителем комбикорма в США. Для оценки стабильности Ecobiol® 500 (B. amyloliquefaciens CECT 5940) был добавлен в стандартный корм для птицы на основе кукурузы и соевого шрота из расчета 500 г на тонну для получения конечной ожидаемой концентрации 1×106 КОЕ/г для каждой партии корма. Кормовую смесь выдерживали в кондиционере в течение 6 минут при 85,5; 87,8 и 90,5°C и затем гранулировали при этих же температурах. Партии корма создавались для каждой температуры гранулирования с учетом добавления (перед гранулированием) различных концентраций Termin-8®, как показано в табл. 2.
Затем гранулированный корм высушивали и охлаждали при температуре примерно 21°С со временем выдержки 15 минут. В негранулированной кормовой смеси общее количество спор подсчитывали в образцах от выработки в каждом из трёх температурных режимов и без добавления Termin-8®. Отбор проб производился при выгрузке кормовой смеси из смесителя сразу после смешивания через равные интервалы времени. Таким образом было отобрано по 10 образцов для каждого температурного режима. От гранулированных кормовых смесей с различными температурами гранулирования и различными концентрациями Termin-8® были отобраны по 10 образцов от каждой группы температуры и концентрации Termin-8® (30, 50 и 50 образцов — для 85,5; 87,8 и 90,5°C соответственно). Образцы корма анализировали на количество спор с помощью посева методом последовательных разведений (VDLUFA 28.2.2). Результаты были переведены в log10 колониеобразующих единиц на грамм корма (log10 КОЕ/г). Анализ проводился с помощью статистического программного обеспечения JMP® v13.1.0, а результаты представлены в виде средних значений и стандартных отклонений (SD). Кроме того, на основе значений log10 КОЕ/г кормовых смесей (базовый уровень) для каждой температуры была рассчитана средняя степень восстановления спор, выраженная в процентах.
Результаты и обсуждение Средние значения log10 КОЕ/г для количества и степени восстановления спор Bacillus spp. представлены в табл. 4. В целом результаты показали, что споры Bacillus amyloliquefaciens CECT 5940 могут выдерживать до шести минут при температурах гранулирования как 87,8°С, так и 90,5°С. Степень восстановления для обеих температур составила 98 и 93% соответственно (рис. 4А).
Оценка различных концентраций Termin-8®, связанных с гранулированием, показала, что при введении 0,5 кг/тонну степень восстановления как для 87,8°С, так и для 90,5°С была выше 94% (рис. 4В). При введении 1 кг/тонну, как показано на рис. 4С, степень восстановления спор составила 93; 94 и 90% для 85,5; 87,8 и 90,5°С соответственно.
Более того, введение Termin-8® в количестве 2 кг/тонну показало восстановление 89; 82 и 73% при 85,5; 87,8 и 90,5°С соответственно (рис. 4D). Введение Termin-8® в количестве 3 кг/тонну в сочетании с гранулированием при всех температурах привело к значительному снижению количества спор (приведенные результаты показывают минимальный обнаруживаемый уровень, табл. 3).
Результаты показали устойчивость спор Ecobiol® (Bacillus amyloliquefaciens CECT 5940) в гранулированном корме, выдерживаемом в течение 6 минут при температуре вплоть до 90,5°С. Споры Ecobiol® (Bacillus amyloliquefaciens CECT 5940) продемонстрировали совместимость с добавляемым перед гранулированием формальдегид-содержащим продуктом (Termin-8®) в концентрациях от 0,5 до 2 кг на тонну корма. Применение Termin-8® в количестве 3 кг/тонну с температурами гранулирования 85,5; 87,8 и 90,5°С привело к уменьшению восстановления спор Ecobiol® (Bacillus amyloliquefaciens CECT 5940) в корме.
Заключение В современном промышленном животноводстве отмечается стремление к сокращению использования кормовых антибиотиков и их замене альтернативными препаратами. В качестве одной из наиболее перспективных альтернатив антибиотикам рассматриваются пробиотики — живые микробиологические кормовые добавки, которые положительно влияют на животное путем улучшения баланса его кишечной микрофлоры. В связи с тем, что пробиотики являются живыми микроорганизмами, контроль за чистотой и жизнеспособностью самих пробиотических продуктов, а также наличие достаточного количества живых спор в кормах становятся важными составляющими эффективного промышленного производства пробиотиков. Когда корм гранулируется и/или обрабатывается любым химическим средством, предназначенным для уменьшения числа патогенов, стабильность используемого штамма имеет решающее значение. Высокая степень восстановления в гранулированных кормах, а также заявленная чистота и активность продукта гарантируют наличие достаточного количества жизнеспособных спор в готовом корме и, соответственно, дальнейший положительный эффект в кишечнике животного.
В рамках технической поддержки своих клиентов компания «Эвоник» предлагает тестирование как самих пробиотических продуктов, так и кормов с этими продуктами для гарантии и контроля эффективности их применения.
|